دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی استان قزوین دانشکده پزشکی شهید بابایی پایان نامه جهت اخذ درجه دکترای عمومی پزشکی عنوان:

1

دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی استان قزوین دانشکده پزشکی شهید بابایی پایان نامه جهت اخذ درجه دکترای عمومی پزشکی عنوان: بررسی فراوانی اینتگرون کالس یک در ایزوله های کلبسیال پنومونیه جمع آوری شده از بیمارستان های شهرهای تهران و قزوین استاد راهنما: آقای دکتر امیر پیمانی استاد مشاور: آقای دكتر امیر جوادی نویسنده: حسین فقیه تابستان 94 2

عناوین صفحه چکیده... 4 مقدمه و اهمیت موضوع... 6 معرفی خانواده انتروباکتریاسه... 6 ویژگی های شاخص و مشترک خانواده انتروباکتریاسه... 9 گونه های کلبسیال... 12 مقاومت های دارویی... 12 مکانیسم های ایجاد مقاومت در باکتری ها... 13 منشاء غیر ژنتیکی مقاومت... 17 منشاء ژنتیکی مقاومت... 17 اینتگرون ها... 18 پنی سیلین های طبیعی... 20 پنی سیلین های نیمه صناعی... 21 سفالوسپورین ها و سفامایسین ها... 21 کارباپنم ها... 23 مونوباکتام ها... 24 اصول طبقه بندی بتاالکتامازها... 26 تعریف آمینوگلیکوزیدها... 33 مکانیسم های مقاومت به فلوروکینولونها... 34 الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در بخش مراقبت ویژه ICU( )...35 اهمیت بالینی جداسازی اینتگرون ها... 36 فاکتورهای خطر در انتشار اینتگرون ها...36 روش های کنترل عفونت... 37 هدف اصلی... 38 3

اهداف فرعی... 38 اهداف کاربردی... 38 فرضیات یا سواالت پژوهشی... 38 فصل دوم مروری بر مطالعات انجام شده... 39 فصل سوم : مواد و روش ها جامعه مورد مطالعه و روش نمونه گیری... 43 نمونه برداری... 44 تعیین الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی به روش 45...Disk Agar Diffusion بررسی ملکولی شیوع اینتگرون کالس یک... 46 استخراج 47...DNA آماده سازی پرایمرها... 47 48... انجام آزمون PCR آماده سازی واکنشPCR... 49 برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر (Thermocycler)...50 الکتروفورز محصوالت 50...PCR کنترل کیفی... 51 بررسی ارتباط بین حضور اینتگرون و مقاومت آنتی بیوتیکی... 51 فصل چهارم: یافته ها الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی... 55 شناسایی ملکولی اینتگرون کالس یک... 56 ارتباط مابین حضور اینتگرون کالس یک و الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی... 57 فصل پنجم بحث و نتیجه گیری نهایی... 58 پیشنهادات... 64 منابع... 65 4

جداول و نمودارها جدول 1-1 : طبقه بندی خانواده کلبسیالیاسیه... 8 جدول 2-1 : طبقه بندی بتاالکتامازها... 29 جدول 3-1 : ژن های بتاالکتامازی کالس ملکولی A با منشا اینتگرون... 31 جدول 4-1 : ژن های بتاالکتامازی کالس ملکولی B با منشا اینتگرون... 32 جدول 5-1 : ژن های بتاالکتامازی کالس ملکولی D با منشا اینتگرون... 33 جدول 1-3 مقادیر بهینه برای تهیه master mix یک واکنش 45...PCR تصویر 1-3: انجام الکتروفورز محصول 48...PCR جدول 3-3: شرایط برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر در یک واکنش 50...PCR نمودار 1-4 : فراوانی ایزوله های گونه های کلبسیال بر حسب بخش های بیمارستانی... 56 نمودار 2-4 : فراوانی ایزوله های گونه های کلبسیال بر حسب نمونه های بالینی... 54 نمودار 3-4 : فراوانی ایزوله های گونه های کلبسیال بر حسب جنس... 54 جدول 1-4: حضور اینتگرون کالس یک در ایزوله های گونه های کلبسیال با مقاومت دارویی چندگانه... 56 جدول 2-4: بررسی مقایسه ای الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی ایزوله های گونه های کلبسیال اینتگرون مثبت و منفی... 58 5

چکیده: معرفی: گونه های کلبسیال به عنوان یکی از عوامل مهم عفونت های بیمارستانی است که عفونت های مختلفی را ایجاد می کند. در سالهای اخیر گزارشات فراوانی مبنی بر حضور گونه های کلبسیال با الگوی مقاومت دارویی چندگانه در بخش های بالینی بیمارستان های سراسر جهان وجود دارد. اینتگرون کالس یک شایعترین کالس اینتگرونی دخیل در انتقال فاکتورهای مقاومت دارویی در ایزوله های کلبسیال است که مقدمات ایجاد ایزوله های مقاوم را فراهم می سازد. هدف از این مطالعه بررسی شیوع اینتگرون کالس یک در ایزوله های کلبسیال و بررسی ارتباط ما بین حضور اینتگرون کالس یک و الگوهای مقاومت دارویی در ایزوله های این ارگانیسم است. در مجموع روش کار: 100 ایزوله بالینی کلبسیال از بیمارستان های مورد مطالعه در قزوین و تهران جمع آوری شد. تمامی ایزوله ها ابتدا با روش های استاندارد آزمایشگاهی تعیین هویت شدند و سپس الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی در برابر آنتی بیوتیک های منتخب به روش CLSI استاندارد دیسک آگار دیفیوژن )کربی بوئر( مطابق دستورالعمل انجام شد. در ادامه تمامی ایزوله ها از نظر حضور اینتگرون کالس یک با استفاده از آزمون PCR بررسی شدند و ارتباط مابین حضور اینتگرون و الگوی مقاومت دارویی چندگانه و همچنین الگوهای مختلف دارویی مقاومت سنجیده شد. نتایج: از مجموع 100 ایزوله 63 ایزوله )63%( الگوی مقاومت دارویی چندگانه را نشان دادند. در بین ایزوله های با مقاومت دارویی چندگانه 52 ایزوله )5/82%( دارای اینتگرون کالس یک بودند. کامال" ارتباط معنی داری مابین الگوی مقاومت دارویی چندگانه و حضور اینتگرون کالس یک مشخص شد. همچنین در ادامه مشخص شد که ارتباط معنی داری مابین حضور اینتگرون کالس یک و مقاومت به آمینوگلیکوزیدها و اکثر داروهای بتاالکتام وجود داشت. 6

بحث: نتایج این مطالعه حاکی از شیوع باالی اینتگرون کالس یک در ایزوله های جدا کلبسیال شده از بخش های بالینی بیمارستان های مورد مطالعه است. با توجه به ارتباط معنی حضور دار اینتگرون کالس یک در گونه های مقاوم جدا شده از بیمارستان های مورد مطالعه اعمال ابزارهای مناسب کنترل عفونت و راهکارهای مناسب درمانی در بخش های مختلف بیمارستان مورد مطالعه برای جلوگیری از انتشار بیشتر آنها ضروری است. 7

مقدمه و اهمیت موضوع: بیماری های عفونی و درمان آنها از مشکالت اساسی زندگی بشر می باشند که نوع آدمی همواره از بدو پیدایش و زیستن به گونه ای با آن ها دست به گریبان بوده است. پس از گذشت سالیان متمادی از آغاز عصر شیمی درمانی ضد میکروبی درمان بیماریها به سبب ظهور سویه های مقاوم میکروبی بیش از پیش پیچیده شده است. بطوری که کاربرد داروهای ضد میکروبی در معرض تحلیل انتقادی زیادی قرار گرفته است. هر چند در ابتدا مقاومت ها نسبت به برخی از آنتی بیوتیک ها از سراسر جهان گزارش می شد ولی در سالهای اخیر شاهد بروز ایزوله های باکتریایی با الگوی مقاومت دارویی چندگانه هستیم. بنا به اهمیت و نقش قابل توجه باکتری های خانواده کلبسیالیاسیه در ایجاد عفونت های مختلف در کلینیک و بیمارستان ها به عنوان محیطهای غنی از انواع آنتی بیوتیک در حال حاضر شاهد افزایش بروز اعضای این خانواده با الگوی مقاومت دارویی چندگانه هستیم. در سال 1970 نقش عناصر ژنتیکی سیار از جمله پالسمیدها در ایجاد مقاومت های دارویی مختلف شناسایی شد و در سال های بعد یعنی اواخر دهه 1980 نقش اینتگرون ها به عنوان دیگر عنصر سیار ژنتیکی دخیل در انتقال فاکتور های مقاومت دارویی مشخص تر شد. معرفی خانواده انتروباکتریاسه: خانواده ی انتروباکتریاسه گروه بزرگی از باکتری ها هستند که به طور طبیعی در آب خاک و مواد در حال فساد و تجزیه وجود دارند ولی جایگاه اصلی آنها در روده ی انسان ها و حیوانات می باشد و به همین جهت به نام باکتری های انتریک یا روده ای از آنها یاد می شود. اعضای این از بعضی خانواده از جمله سالمونال و شیگال از عوامل مهم گاستروانتریت می باشند) 1 (. بیش از بیست و ده گونه صد یک جنس و و پنج در این گروه از باکتری ها تشخیص داده شده اند که بیست تا بیست و پنج گونه ی آن ها از نظر کلینیکی مهم هستند. بخش عمده ای از اعضای این خانواده جزء نرمال فلور روده بوده و در عملکرد نرمال روده نقش دارند. باکتری های 8

کلبسیال جنس نیز به عنوان اعضای مهم خانوده انتروباکتریاسه به عنوان فلور طبیعی در روده حضور دارند. این ارگانسیم ها گاهی در تعدادکم به عنوان جزئی از فلور طبیعی مجاری فوقانی تنفسی و مجاری تناسلی یافت می شوند. این باکتری ها عموما در خاستگاه واقعی خود بیماری ایجاد نمی کنند اما وقتی که به بافت های خارج از محل طبیعیشان وارد شوند می توانند بیماری ایجاد کنند و به همین جهت پاتوژن های فرصت طلب محسوب می شوند) 1 (. 7 در حال حاضر بر اساس جدیدترین طبقه بندی خانواده انتروباکتریاسه تقسیم می گروه به را کنند که عبارتند از: 1- Eschericeae : اشرشیا مانند اشرشیا کولی) )E.coli و شیگال 2- Salmoneleae : شامل سالمونال آریزونا و سیتروباکتر Edvardsieleae- 3 : شامل ادواردسیال :Proteae شامل پروتئوس ها مورگانال و پروویدنسیا -4 Kelebsielleae- 5 :شامل کلبسیال کلبسیال هافنیا و سراشیا Yercinieae- 6 :شامل یرسینیا - 7 :Erwiniae شامل اروینیا )بیشتر در گیاهان وجود دارند و غیر بیماری زا هستند( )2(. 9

جدول 1-1 : طبقه بندی خانواده کلبسیالیاسیه) 2 ( 10

ویژگی های شاخص و مشترک خانواده انتروباکتریاسه: این باکتری ها از لحاظ ساختاری به شکل میله ای کوتاه و گرم منفی هستند. هوازی- بی هوازی اختیاری هستند. تخمیر گلوکز را به اکسیداسیون آن ترجیح می دهند که این امر غالبا با تولید گاز همراه - - - است. می توانند نیترات را به نیتریت احیاء نمایند. فاقد اسپورند. - - برخی از اعضای این خانواده به واسطه تاژک هایی که در سرتاسر سلول وجود دارد - متحرکند و برخی از آنها غیر متحرک اند. - روی محیط های کشت حاوی پپتون یا عصاره ی گوشت بدون اضافه کردن سدیم کلراید یا مواد دیگر رشد می کنند. روی محیط مک کانکی آگار به خوبی رشد می کنند. غالبا روی محیط کشت کلنی های گرد و محدب با لبه های صاف ایجاد می کنند. )جاوتز( در محتوای مولکول DNA درصد شمارش "G+C" 39 تا %59 است) 1 2(. - - - گونه های کلبسیال ارگانیسم های جنس کلبسیال )با نام قبلی آئروباکتر( ساکن آب و خاک بوده و با شیوع کمتری در روده بزرگ انسان و حیوان حضور دارند. این ارگانیسم متحرک بوده و به سادگی بر روی محیط های کشت معمول آزمایشگاهی رشد می کند. هر چند این ارگانیسم ها نسبت به ارگانیسم های جنس کلبسیال و اشریشیاکلی کمتر از نمونه های بالینی جدا می شوند اما توانایی ایجاد عفونت در هر یک از اعضای بدن را دارند. در حال 11

حاضر گزارشات فراوانی از ایجاد عفونت های مختلف بالینی به ویژه در محیط های بیمارستانی از این ارگانیسم وجود دارد. این ارگانیسم ها در ایجاد بیماری های مهمی از جمله پنومونی عفونت های مجاری ادراری) UTI ( )خصوصا در ارتباط با کاتترهای ادراری( مجاری تحتانی تنفسی پوست بافت نرم خون و هم چنین نقش آن ها در بیماری هایی مثل آندوکاردیت باکتریمی ورم عفونی مفاصل التهاب های موضعی استخوان و عفونت های چشمی در بخش های مختلف بیمارستانی به ویژه بخش ICU وجود دارد. کلبسیالها هم چنین می توانند سبب عفونت زخم و نواحی جراحی نیز بشوند. همچنین این باکتری ها به میزان کمتر از سینوزیت بیمارستانی مننژیت های مرتبط با جراحی مغز و اعصاب استئومیلیت مننژیت سپسیس نوزادی )خصوصا در نوزادان نارس( و باکتریمی )به ویژه در بیماران همراه با تب و نوتروپنی( و به ندرت اندوکاردیت جدا شده اند) 3-6(. گونه های مختلف جنس کلبسیال که تا کنون شناسایی شده اند به شرح ذیل می باشند: -Enterobacter aerogenes -Enterobacter cloacae -Enterobacter agglomerans -Enterobacter gergoviae (medical-dictionary.thefreedictionary.com) -Enterobacter amnigenus -Enterobacter asburiae -Enterobacter cancerogenus -Enterobacter cowanii -Enterobacter dissolvens -Enterobacter hormaechei 12

-Enterobacter intermedius -Enterobacter kobei -Enterobacter ludwigii -Enterobacter nimipressuralis -Enterobacter pyrinus -Enterobacter sakazakii از میان گونه های فوق الذکر دو گونه ی کلبسیال کلواکه و عنوان مهمترین به آئروژنز کلبسیال عوامل ایجادکننده ی عفونت های بیمارستانی محسوب می شوند جدا می شوند) 7 (. و غالبا" از عفونت های بالینی با بررسی بیشتر مطالعات مشخص شده است که بیشترین موارد ابتال به این ارگانیسم افراد در مسن افراد با بیماریهای زمینه ای و افراد بستری در بخش های بحرانی بیمارستان از جمله ICU گزارش می شود. همچنین این باکتری ها در محیط های بیمارستانی غالبا از طریق پرسنل بیمارستان و به هنگام هم چنین استفاده از ابزارهایی همچون کاتترهای ادراری کاتترهای داخل عروقی و لوله های تراشه بین بیماران انتشار می یابند و در بیمارانی که به مدت طوالنی بستری می شوند و یا بیمارانی که از سیستم ایمنی با کارایی کافی برخوردار نیستند)مانند هنگام از دست رفتن عملکرد نوتروفیل ها و ایمنی سلولی و هومورال( در هم چنین و کودکان و سالخوردگان مشکالت عدیده ای را پدید می آورند. این مشکالت زمانی پیچیده تر می شوند که بیمار به داروهای ضد میکروبی پاسخ نداده و به عبارت بهتر باکتری های ایجاد کننده ی بیماری به داروهای معمول مقاوم شده باشند) 8-11 (. 13

مقاومت های دارویی: داروهای ضد میکروبی از پرمصرف ترین انواع داروها هستند که در صورت استفاده صحیح نجات بخش خواهند بود و در عین حال استفاده نادرست و نابجا باعث افزایش هزینه عوارض مقاومت دارویی و بی ارزش شدن آنها می گردد. استفاده منطقی از داروهای ضدمیکروبی به نحوه فهم عملکرد فارماکوکنتیک عوارض دارویی تداخالت و روش های کاهش مقاومت و حساسیت میکروبی در آزمایشگاه بستگی دارد. پدیده بروز "مقاومت دارویی" چند سال است که توجه دانشمندان و محافل علمی را به خود جلب کرده است. پیش بینی می شود که با وجود سرعت بسیار باالی ایجاد مقاومت دارویی تا چند دهه دیگر همه آنتی بیوتیک ها بی اثر خواهند شد و این یعنی این که شاید بشر به دوران قبل از کشف پنی سیلین باز گردد! زیرا هر از گاهی گزارشاتی جدید از بروز مقاومت دارویی به آنتی بیوتیک ها منتشر می گردد. در حال حاضر پزشکان در درمان بیماران مبتال به این میکروارگانیسم های مقاوم دچار محدودیت های فراوانی می باشند چرا که به سبب بروز مقاومتهای متنوع دارویی بسیاری از این داروهای شگفتی آفرین که تا کنون زندگی انسان های بی شماری را نجات داده اند به آخر خط رسیده اند. منظور از مقاومت آنتی بیوتیکی توانایی باکتری یا سایر میکروب ها به مقاومت در برابر اثر آنتی بیوتیک ها با استفاده از مکانیسم های متفاوت است. اگر چه تعداد زیادی از موارد مقاومت به دارو در باکتری ها یک صفت ذاتی است اما در بسیاری از موارد نیز این پدیده در اثر فشار آنتی بیوتیکی ایجاد شده و در واقع به وسیله ی ارگانیسم کسب می گردد) 12-14(. 14

مکانیسم های ایجاد مقاومت در باکتری ها: تغییر نفوذ پذیری میکروارگانیسم نسبت به دارو: کاهش نفوذ پذیری از طریق عملکرد کانال های غشاء سلولی )پورین ها( اعمال می شود که - اجازه ی ورود دارو را به داخل سلول نمی دهند. ژن های این نوع مقاومت غالبا منشاء پالسمیدی دارند. )15-17( - از طریق پمپ افالکس: میکروارگانیسم کانال های پروتئینی متعددی در غشاء دارد که در انتقال تعداد زیادی از مواد غذایی و ترکیبات سمی نقش دارند. در میان این انتقال دهنده ها پمپ های efflux نقش اساسی در خروج آنتی بیوتیک ها از داخل سلول داشته و این مواد را از درون سلول به محیط خارج پمپ می کنند. بنابراین باعث کاهش غلظت آنتی بیوتیک ها در فضای پری پالسمی باکتری های گرم منفی می گردند. افزایش بیان یک یا چند پمپ efflux باعث ممانعت از تجمع داخل سلولی در حد آستانه ی مورد نیاز برای فعالیت داروها می گردد. )18-20( - تغییر گیرنده های میکروارگانیسم برای داروها: ژن های این نوع مقاومت ها غالبا کروموزومی هستند. برای مثال مقاومت به آمینوگلیکوزیدها که منشاء کروموزومی دارد معموال همراه با از دست دادن یا عوض شدن پروتئین هایی است که در قطعه ی کوچک ریبوزوم به عنوان گیرنده ی دارو عمل می کنند و یا تغییر در پروتئین های اتصالی به پنی سیلین ها (PBPs) به ویژه PBP-2 که نقش بسزایی در شکل گیری ساختمان باکتری دارد) 21 (. - دستیابی میکروارگانیسم به مسیرهای متابولیک فرعی : این امر واکنش مهار شده توسط دارو را جبران می نماید. به عنوان مثال در باکتری ها یکی از عوامل سازنده ی اسید فولیک است. اگر آنزیم "دی هیدرو پتروات سنتتاز" PABA که وظیفه تبدیل PABA به اسیدفولیک را عهده دار است توسط سولفونامید مهار شود 15

دیگر نمی تواند در واکنش تبدیل PABA به اسید فولیک شرکت نماید و در نتیجه اسید فولیک ساخته نمی شود. اسید فولیک در سنتز اسیدهای نوکلئیک نقش مهمی دارد و به همین جهت عدم سنتز آن به توقف رشد سلول منجر می گردد. برخی از باکتری ها نیاز به خارج سلولی ندارند و همانند سلول های پستانداران می توانند از اسید فولیک از PABA پیش تشکیل شده استفاده کنند و به همین دلیل به سولفونامید مقاومند) 22 (. - تولید آنزیم های بتاالکتاماز: این آنزیم ها سبب تخریب داروی فعال می گردند. ژن های این نوع مقاومت های دارویی اکثرا از طریق پالسمید منتقل می شوند. برای مثال پالسمیدهای مسئول مقاومت نسبت به پنی سیلین و سفالوسپورین ها دارای ژن های مربوط به سنتز آنزیمی به نام بتاالکتاماز یا پنی سیلیناز می باشند که حلقه ی بتاالکتام موجود در هسته ی مرکزی این داروها را تخریب کرده و ترکیب غیر فعالی به نام اسید پنی سیلوئیک یا اسید فنولیک باقی می گذارد. در مجموع مقاومت با جهش ژن ها یا اکتساب ژن جدید به وجود می آید. ژن های جدید عامل مقاومت معموال سلول به سلول توسط عناصر متحرک ژنتیکی مثل پالسمید ترانس پوزون و باکتریوفاژ منتشر می شوند. هم چنین ژن های بسیاری از بتاالکتامازهای جدید بر روی اینتگرون ها یافت شده است. اینتگرون ها عناصری هستند که می توانند در پالسمیدها کروموزوم ها و یا ترانس پوزون ها جای گیرند. این عناصر از جمله فاکتورهای دخیل در توسعه ی مقاومت های چندگانه بوده و همانند پالسمیدها و ترانسپوزون ها جزء مولفه های ژنتیکی متحرک در کسب و انتشار عوامل مقاومت می باشند) 23 (. مطابق نظریه ترکیبی انتخاب طبیعی اثبات شده است که در جایی که مقدار زیادی داروهای ضد میکروبی مصرف می شود باکتری های مقاوم به آنتی بیوتیک به سبب شانس بقای بیشتر نسبت به باکتری های غیر مقاوم)حساس به آنتی بیوتیک( باقی مانده و تکثیر می کنند. در نتیجه 16

فراوانی نسبی شان به تدریج افزایش می یابد و اغلب افراد جمعیت را همین باکتری های مقاوم تشکیل می دهند. در حال حاضر داروهایی که به طور معمول برای درمان بیماریهای ناشی از گونه های کلبسیال مورد استفاده قرار می گیرند از خانواده ی داروهای بتاالکتام می باشند که از دیواره ی سلولی" عمل می نمایند: "مهار سنتز طریق چنان که می دانیم دیواره ی سلولی باکتری ها به عنوان یک الیه ی مستحکم عالوه برتعیین شکل میکروارگانیسم از سلول باکتری در مقابل فشار اسموتیک باالی آن محافظت می کند. آسیب به دیواره ی سلول چه از طریق تاثیر آنزیم های لیزوزومی و چه از طریق مهار تولیدآن توسط دارو به متالشی شدن آن خواهد انجامید. این دیواره از یک پلیمر پپتیدوگلیکان )مورین( پیچیده و دارای پیوند متقاطع تشکیل شده است. استیل مورامیک اسید استیل گلوکزآمین (NAG) و N این پلی ساکارید حاوی قندهای N (NAM) به شکل یک درمیان می باشد یک پپتید پنج اسید آمینه ای )پنتاپپتید( نیز به متصل میباشد. این پپتید به D آالنین- D آالنین ختم می شود. در طول ساخته NAM شدن دیوارة سلولی پروتئین هایی به نام پروتئین های متصل شونده به پنی سیلین ( PBPs )که در واقع گروه بزرگی از آنزیم های کربوکسی پپتیداز و ترانس پپتیداز هستند با جدا کردن D آالنین انتهایی باعث شرکت دی آالنین ماقبل آخر در واکنش ایجاد تقاطع عرضی)ترانس پپتیداسیون( می شوند و به این ترتیب نقش خود را در ساخت دیواره ی سلولی باکتری ایفا می نمایند. داروهای بتاالکتام با اتصال به این پروتئین ها )PBPs( عمل ترانس پپتیداسیون یعنی ایجاد اتصال متقاطع در ساخت دیواره ی سلولی را مهار می کنند در نهایت آنزیمهای اتولیتیک که هیدروالزهای مورین نام دارند فعال شده و موجب تخریب پپتیدوگلیکان می شوند به این ترتیب 17

سلول با از دست دادن دیواره در مقابل فشار باالی اسمزی درون خود تاب نیاورده و متالشی خواهد شد. ارتباط بین مهار فعالیت PBP ها و فعال شدن آنزیم های اتولیزین هنوز بدرستی مشخص نیست. ترانس پپتیدازها عموما در فضای پری پالسمی قراردارند. داروهای بتا الکتام در باکتریهای گرم مثبت با انتقال مستقیم و در باکتریهای از گرم منفی یا طریق کانال های پورین و یا از طریق انتشار ثانویه از غشاء خارجی باکتریها به درون راه یافته و با PBP ها به شکل کوواالن واکنش می دهند و در واقع با استیله کردن این آنزیم ها آنها را غیرفعال می سازند. PBP تعداد PBP ها در باکتریها متفاوت است و هر یک از آنتی بیوتیک های بتاالکتام به خاصی متصل می شود. به عنوان مثال استافیلوکوک ها 4 نوع PBP دارند و اشریشیاکلی حداقل PBP1a,1b نوع PBP دارد. در اشرشیاکلی که وزن مولکولی باالیی دارد درواقع ترانس 7 پپتیدازی است که مسئول ساخت پپتیدوگلیکان می باشد. مهار ترانس پپتیدازها می تواند باعث تشکیل اشکال کروی در این باکتری ها و لیز سریع آنها شود. مهار سایر PBP ها ا زجمله PBP- 2 ممکن است که با تأخیر بیشتری باعث لیز باکتریها شود و یا اینکه با مهار PBP-3 باکتریها به شکل رشته ای در آیند) 24 (. فراوان ترین و مهم ترین مکانیسم مقاومت به داروهای بتاالکتام تولید آنزیم های هیدرولیز کننده بتاالکتام ها می باشد. درواقع این آنزیم ها که سرین پروتئاز هستند با اتصال به آنتی بیوتیک های بتاالکتام و با ایجاد پیوند کوواالن و با تخریب پیوند آمیدی موجب غیرفعال شدن این می داروها شوند. به طور کلی مقاومت به دارو در باکتری ها به سبب عناصر ژنتیکی و یا ماهیت غیر ژنتیکی اتفاق می افتد. 18

منشاء غیر ژنتیکی مقاومت: آنتی بیوتیک هنگامی بر باکتری موثر است که باکتری از لحاظ متابولیکی فعال باشد. باکتری هایی که از لحاظ متابولیکی غیر فعال اند و در حال رشد و نمو نیستند نسبت به دارو مقاومند. از آنجایی که بیشترین فعالیت متابولیکی باکتری ها در فاز لگاریتمی رشد آن ها مشاهده می شود این ارگانیسم ها بیشترین حساسیت خود را به آنتی بیوتیک ها در این فاز نشان می دهند. به عنوان مثال باکتری هایی که به مدت چند سال پس از عفونت در نسوج زنده باقی می مانند و در عین حال توسط سیستم ایمنی میزبان محدود شده و تکثیر نمی یابند در مقابل درمان مقاوم بوده و نمی توان آن ها را با دارو ریشه کن کرد. چنان چه این ارگانیسم ها مثال به دنبال مهار و تضعیف ایمنی سلولی شروع به تکثیر کنند به همان داروها حساس خواهند بود) 25 (. منشاء ژنتیکی مقاومت: الگوهای ژنتیکی مقاومت دارویی شامل: - دارای منشاء کروموزومی: این امر به صورت موتاسیون خودبه خودی برروی ژن های کنترل کننده ی حساسیت باکتری روی می دهد. این گونه مقاومت معموال بر اساس تغییر در گیرنده های دارو در باکتری عمل می کند. دارای منشاء خارج کروموزومی: در این حالت فاکتور های مقاومت غالبا" از طریق - عناصر سیار ژنتیکی انتقال می یابد. این فاکتورهای مقاومت به طور شاخص از طریق پالسمیدهای کنژوگه که حاوی ژن های مقاومت نسبت به یک یا چند داروی ضد میکروبی هستند و طی مکانیسم های مختلف از جمله کونژوگاسیون از یک باکتری به باکتری دیگر منتقل می شوند. ژن های موجود بر روی پالسمیدها معموال بر اساس تولید آنزیم های غیر فعال کننده ی دارو عمل می کنند. در سال های اخیر به خوبی مشخص شده است که طیف عمده ای از این الگوهای 19

مقاومت به واسطه کسب سایر عناصر ژنتیکی سیار حاوی ژن های مقاوم نیز ایجاد می شوند که به واسطه این پدیده ژن های مقاومت دارویی از طریق انتقال افقی به سایر گونه ها و حتی جنس های دیگر باکتریایی انتقال می یابد. این عناصر سیار ژنتیکی غالبا از جنس ترانسپوزون فاژ و اینتگرون ها هستند که پتانسیل باالیی برای انتقال ژن های مقاومت دارویی نشان می دهند) 26 (. اینتگرون ها مطالعات اخیر حاکی از نقش قابل توجه و مهم اینتگرون ها در انتشار ژن های مقاوم در بخش های مختلف بیمارستانی است که غالبا این ژن های مقاومت بر روی کاس ت های ژنی مشخص قرار دارند که به سبب قابلیت اتصال این کاست ها در مجموعه های اینتگرونی طی فرایند نو ترکیبی اختصاصی در جایگاه Recommbination( )Site Spesific انتقال ژن های مقاومت صورت می پذیرد. ماهیت اصلی اینتگرون ها به سبب ژن اینتگراز )IntI( می باشد که کد کننده آنزیم ریکامبیناز اختصاصی در جایگاه بوده و مقدمات اتصال یا جدا سازی کاست های ژنی کوچک را درجایگاه اتصال ( atti ( فراهم می سازد. کاست های ژنی معموال حاوی یک ژن ( غالبا ژن های مقاومت دارویی ) و یک جایگاه محافظت شده به نام Att c بوده که مقدمات شناسایی اینتگراز طی فرایند اتصال و برش را فراهم می سازد کاست ها معموال فاقد پروموتور بوده اما بعد از اتصال به اینتگرون از پروموتور آن جهت بیان ژن های انتقال یافته استفاده می کنند. 20

تصویر 1-1 : نمونه ای از ساختار شماتیک اینتگرون کالس یک) 27 ( گزارشات مختلف از اقصی نقاط جهان حاکی از حضور اینتگرون ها در طیف وسیعی از از باکتری ها است و تا کنون بیش از 8 کالس از آن ها شناسایی شده است. در مطالعاتی که الگوهای ( ژنتیکی مقاومت دارویی را مورد بررسی قرار دادند کالس های اینتگرونی 3 به ویژه و 2 1 اینتگرون کالس یک( از اهمیت باالیی در انتقال ژن های مقاومت برخوردار بودند. در این مطالعات ارتباط معنی داری بین حضور این کالس های اینتگرونی با مقاومت به کالس های آنتی بیوتیکی عمده مصرفی در بیمارستان ها اثبات شده است) 27 (. 21

کاست های ژنی که در این اینتگرون ها شناسایی شده است غالبا متغییر بوده به طوری که تاکنون بیش از 60 کاست ژنی متفاوت تا به حال شناسایی شده اند که مقدمات مقاومت به آنتی بیوتیک های مهمی از جمله آمینوگلیکوزیدها پنی سیلین ها سفالوسپورین ها کرباپنم ها تریمتوپریم ها کلرامفنیکل ریفامپین و اریترومایسین و ترکیب های چهار گانه آمونیومی را فراهم می سازد. جالب است که مطالعات زیادی اینتگرونهای حاوی بیش از یک کاست ژنی را گزارش کرده اند که ایزوله های باکتری های حاوی آن ها را مستعد داشتن الگوی مقاومت دارویی چندگانه Resistance( )Multipe Antibiotic می کند) 28 (. به ویژه در خصوص بتاالکتامازها وجود ژنهای مقاومت کالسهای ملکولی A طبقه بندی امبلر)بجز TEM و )SHV و کالس B و D که مقدمات مقاومت به طیف وسیعی از داروهای بتاالکتام را فراهم می کنند بر روی کالس های مختلف اینتگرونی به ویژه اینتگرون کالس یک اثبات شده است. بنا به اهمیت داروهای بتاالکتام که به ویژه از نظر اثر بخشی و طیف وسیعی از میکروارگانیسم های بیمارستانی و همچنین اهمیت اینتگرون ها در انتقال کاست های ژنی مقاومت به این داروها ابتدا این داروها به شرح ذیل بحث می شوند. داروهای بتاالکتام به چهار گروه عمده تقسیم می شوند که عبارتند از: پنی سیلین های طبیعی: مثل پنی سیلین G و V که از طریق مهار ترانس پپتیداز از سنتز دیوارة سلولی در باکتریها ممانعت می کنند. تمامی پنی سیلین ها دارای یک حلقه تیازولیدین متصل به یک حلقه بتاالکتام )که خود دارای یک گروه آمین نوع دوم RNH می باشد( هستند. استحکام ساختاری 6- آمینو پنی سیالنیک اسید جهت فعالیت بیولوژیک مولکول آن ضروری است. اگر این حلقه بتاالکتام توسط بتاالکتامازهای باکتریال تخریب شود فرآوردة حاصل فاقد فعالیت ضدباکتریایی خواهد بود) 1 29 (. 22

تصویر 2-1 مربوط به هسته ی پنی سیلین ( عضو شاخص خانواده ی بتاالکتام ها() 1 ( پنی سیلین های نیمه صناعی: پنی سیلین های مقاوم به پنی سیلیناز پنی سیلین - های وسیع الطیف و پنی سیلین های ضد سودوموناس) 1 (. - سفالوسپورین ها و سفامایسین ها: این دسته از داروها از بزرگترین خانوادة داروهای بتاالکتام و از مشتقات نیمه صناعی 7- آمینو سفالوسپورانیک می باشند. سفالوسپورین ها نسبت به بسیاری از بتاالکتامازهای باکتریایی از پنی سیلین پایدارترند لذا عمدتا طیف فعالیت گسترده تری دارند. فعالیت ضد میکروبی ذاتی سفالوسپورین های طبیعی اندک است و اتصال گروههای مختلف R2 داروهایی با و اثرات R1 درمانی خوب و اثرات سم ی کم بوجود آورده است. سفالوسپورین ها از لحاظ مکانیسم عمل شبیه پنی سیلین ها عمل می کنند. درواقع بعد از اتصال به PBP ها با مهار عمل ترانس پپتیداسیون از سنتز دیوارة سلولی باکتریها ممانعت می کنند و سرانجام با فعال شدن آنزیم های اتولتیک سلول باکتری از بین خواهد رفت. این دسته از 23

داروهای بتاالکتام را براساس طیف اثر بر باکتری های گرم منفی به چهار دسته تقسیم بندی می کنند) 1 (. نسل اول سفالوسپورین ها این دسته از داروها غالبا بر باکتریهای گرم مثبت مؤثرند و اثرشان بر باکتریهای گرم منفی محدود به باکتریهای روده نظیر اشرشیاکلی کلبسیال و پروتئوس میرابیلیس می باشند. هرچند این داروها نسبتا وسیع الطیف و غیرسمی اند ولی به عنوان داروی انتخابی در درمان هیچ عفونتی به کار نمی روند. از جمله این داروها عبارتند از: سفادروکسیل سفازولین سفالکسین سفالوتین سفاپیرین سفرادین) 1 (. نسل دوم سفالوسپورین ها این دسته از داروها برعلیه باکتری های گرم منفی اثر بیشتری داشته و بر روی باکتریهای گرم مثبت اثری مشابه سفالوسپورین های نسل اول دارند نظیر سفاکلور سفامندول سفونیسید سفپروزیل لوراکایف سفوروکسیم سفورانید و سفامایسین ها که شامل سفوکسیتین ممفتازول و سفوتتان اند که غالبا برعلیه باکتری بی هوازی فعالیت دارند. هرچند که سفالوسپورین های نسل دوم ممکن است که در شرایط آزمایشگاهی علیه گونه های کلبسیال و سیتروباکتر موثر باشند ولی عموما در درمان عفونت های ایجاد شده علیه این ارگانیسم ها به کار نمی روند. زیرا موتانت های مقاوم این باکتریها با تولید یک بتاالکتاماز کروموزومی این داروها و همچنین سفالوسپورین های نسل سوم راهیدرولیز می نماید) 1 29(. نسل سوم سفالوسپورین ها این دسته از داروها به علت داشتن گروههای R بزرگ و غیرمعمول نسبت به عمل بتاالکتامازها مقاومت شدیدی از خود نشان می دهند. این دسته از داروها هرچند که بیشترین 24

طیف اثر را بر روی باکتری های گرم منفی دارند ولی فعالیت شان علیه باکتری های گرم مثبت ناچیز است. این داروها به سبب میل ترکیبی باال به PBP ها در باکتریها و همچنین به سبب مقاومت خوبی که در برابر بسیاری از بتاالکتامازها از خود نشان می دهند داروهای مناسبی هستند. از جمله این داروها عبارتند از: سفوپرازون سفوتاکسیم سفتازیدیم سفتی زوکسیم سفتریاکسون سفکسیم سفپودوکسیم پروگزتیل سفتی بوتین و موگزاالکتام) 29 (. نسل چهارم سفالوسپورین ها این دسته از داروها از نظر اثر بر باکتریهای گرم منفی مشابه نسل سوم بوده و همچنین برعلیه باکتریهای گرم مثبت فعالیت خوبی از خود نشان می دهند. سفپیم نمونه ای از سفالوسپورین های نسل چهارم است. این دارو به دلیل این که نسبت به هیدرولیز بتاالکتامازهای کروموزومی و تا حدی بتاالکتامازهای وسیع الطیف مقاوم است جزو گروه چهارم قرار می گیرد) 30 (. کارباپنم ها این دسته از داروها به طریق صناعی از تینامایسین ساخته می شوند. اگرچه تینامایسین در درمان عفونت های انسانی مورد استفاده قرار نمی گیرد یکی از مشتقات Formimidoyl آن یعنی ایمی پنم به عنوان یکی از وسیع ترین آنتی بیوتیک های بتاالکتام مصرف بالینی دارد. کارباپنم ها ساختمانی دوحلقه ای شامل یک حلقه بتاالکتام و یک حلقه غیراشباع پنج کربنه دارند که به جای اتم کربن در موقعیت 1 آن اتم گوگرد قرار دارد. ایمی پنم با اتصال قوی به و PBP2 PBP1 از عمل ترانس پپتیداسیون ممانعت می کند. این داروها در برابر بسیاری از بتاالکتامازها و همچنین بتاالکتامازهای کروموزومی کالس 1 )که باعث تخریب سفالوسپورین های نسل سوم می گردند( مقاوم هستند. ایمنی پنم به خوبی به سلول های گرم منفی نفوذ کرده و علیه باکتری های بی هوازی نیز موثر است. تجویز ایمی پنم به همراه سفالوسپورین ها جایز نیست چرا که این دارو سبب بیان بتاالکتاماز کروموزومی کالس 1 می گردد. تمامی سفالوسپورین ها 25

توسط بتاالکتاماز کالس 1 غیرفعال می شوند و اسیدکالوالنیک و سولباکتام قادر به غیرفعال کردن بتاالکتاماز کالس 1 به تنهایی نیستند. امروزه کرباپنم ها به عنوان داروی انتخابی در درمان بیماران مبتال به ارگانیسم های تولید کنندة ESBL به کار می روند. این داروها در برابر هیدرولیز کنندگی ESBL ها کامال پایدار بوده و به علت اندازة مولکولی فشرده و ساختار زئوترونیک خود به راحتی از غشاء خارجی عبور می کنند. مطالعات نشان داده که درمان با ایمی پنم در بیماران مبتال به ارگانیسم های مولد ESBL پیامدهای بهتری نسبت به سایر داروهای ترکیبی دارد. در مطالعه ای که اخیرا بر روی سوش های کلبسیالپنومونیه مقاوم به چند دارو در اسکاتلند انجام شد تنها یک ایزوله به ایمی پنم مقاوم بود. که آن هم به علت از دست دادن پروتئین های غشاء خارجی بود. کرباپنم های جدید مانند ارتاپنم و ایمی پنم در درمان ارگانیسم های تولید کننده ESBL مفید است.مطالعات انجام شده حاکی از آن است که ارتاپنم ها در شرایط آزمایشگاهی فعالیت خوبی را علیه ارگانیسم های تولید کننده ESBL نشان می دهند هر چند با ازدست دادن پورین حساسیت این داروها می تواند کاهش یابد) 29 31( مونوباکتام ها: آزترونام مهمترین داروی این خانواده است. این داروها به واسطه داشتن ساختار تک حلقه ای مشخص می شوند. آزترونام اولین منوباکتامی است که در سال 1998 در طب نوزادان توسط USFDA مجوز استفاده را دریافت کرد. این داروها باعث مهار ساخت دیوارة سلولی باکتریها می شوند. مکانیسم عمل این دارو شبیه پنی سیلین و سفالوسپورین بوده و ترجیحا با اتصال به PBP-3 در باکتریها گرم منفی باعث لیز و مرگشان خواهد شد. تمایل آزترونام برای PBP در باکتریهای گرم مثبت و بی هوازی بسیار ناچیز است. در مقایسه با ایمی پنم آزترونام طیف ضد میکروبی محدودی دارد. در مجاورت آزترونام باکتریهای گرم منفی ابتدا به شکل رشته های طویل درآمده و سپس از میان خواهند رفت. هرچند 26

این داروها در برابر خواص هیدرولیزکنندگی بسیاری از بتاالکتامازهای کروموزومی یا پالسمیدی مقاومند ولی مقاومت خود را در برابر بتاالکتامازهای TEM-3 TEM-1, TEM-5 و SHV-2 از دست می دهند) 29 (. تصویر 3-1 محل اثر آنزیم بتاالکتاماز روی حلقه ی بتاالکتام) 1 ( چنان که اشاره شد برخی ژن های ایجاد کننده ی مقاومت ترکیباتی تولید می کنند که بتاالکتاماز نامیده می شوند و قادر به تجزیه بتاالکتام ها می باشند و بنابراین باکتریهای حامل چنین ژن هایی در حضور آنتی بیوتیک های بتاالکتام از بین نمی روند. به عبارت بهتر بتاالکتامازها آنزیم هایی هستند که سبب تخریب حلقه ی بتا الکتام موجود در آنتی بیوتیک های گروه بتاالکتام و هیدرولیز آن ها می شوند. این آنزیم ها منشاء پالسمیدی داشته و به سبب انتقال فاکتور مقاومت به سایر گونه ها حتی دیگر جنس های دخیل در عفونت های بیمارستانی در سال 27

های اخیر مورد توجه بسیاری بوده اند. به عنوان نمونه از چنین ژن هایی می توان به ژن های SHV,PER,CTX و TEM اشاره کرد. نکته این جاست که بروز جهش در این ژن ها و به دنبال آن جایگزینی اسیدهای آمینه در محصول این ژن ها به ویژه در جایگاه فعال آن ها سبب پیدایش بتاالکتامازهایی با طیف اثر وسیع روی انواع آنتی بیوتیک های بتاالکتام از قبیل پنی سیلین ها و سفالوسپورین های نسل اول دوم سوم چهارم )که دارای زنجیره ی جانبی اکسی ایمینو هستند( مانند: سفتازیدیم سفوتاکسیم سفتریاکسون و سفپیم( و منوباکتام ها )مثل آزترونام( می شود. به چنین بتاالکتامازهایی بتاالکتامازهای وسیع الطیف )ESBLs( اطالق میشود. )31-29( اصول طبقه بندی بتاالکتامازها: از سال 1970 چندین معیار جهت طبقه بندی عملکرد بتاالکتامازها استفاده می شود از جمله طیف ضد میکروبی پروفایل سوبسترا پروفایل مهارکنندگی آنزیم ها شارژ آنزیم (PI) وزن Isoelectric focusing, (KM) میزان هیدرولیزکنندگی (Vmax) تمایل اتصال مولکولی پروتئین و محتویات اسید آمینه ای آنها) 32 (. Sykes Richmond در سال 1973 طرح طبقه بندی بتاالکتامازها برای اولین بار توسط و ارائه داده شد که براساس پروفایل سوبسترا حساسیت به مهار کننده ها و Isoelectric focusing یکسانی اندازه و خواص ایمونولوژیکی بتاالکتامازها را به 5 گروه عمده (I-V) تقسیم کرد. البته این طرح طبقه بندی قبل از پیدایش ESBL ها مطرح شد. بنابراین با طرح این طبقه SHV-1 TEM-1,TEM-2 بندی افتراق بین ESBL ها و آنزیم های والد اولیه شان یعنی و ممکن نبود. 28

Bush-Jacoby در سال 1995 بتاالکتامازها را براساس پروفایل سوبسترا پروفایل ممانعت کنندگی و خصوصیات فیزیکی نظیر وزن مولکولی و نقطه ایزوالکتریک به 4 گروه )4-1( و زیر گروه (a-f) مطابق جدول 2 طبقه بندی کردند) 32 (. گروه 1 : شامل سفالوسپورینازهایی هستند که توسط کالوالنیک اسید مهار نمی شوند. این گروه به کالس C تعلق دارند. گروه 2: شامل پنی سیلینیازها و سفالوسپورینازها و یا هر دو می باشند که توسط کالوالنیک اسید مهار می شوند. این گروه مشابه کالس A و D مولکولی می باشند که شامل ژنهای اصلی TEM و SHV هستند ولی به علت تعدد بتاالکتامازهای مشتق شده از این آنزیم ها این گروه به 2 زیر گروه عمده تقسیم می شوند: 2a و 2b. زیر گروه 2a شامل تمام پنی سیلینازها می باشد در حالی که زیر گروه 2b بتاالکتامازهای وسیع الطیف را شامل می شوند بدین معنی که آنها قادرند پنی سیلین ها و سفالوسپورین ها را به صورت یکسان هیدرولیز نمایند. به همین دلیل زیر گونه های زیر از زیرگروه 2b مشتق شده اند که عبارتند از: (ESBLs) زیرگروه :2be که شامل بتاالکتامازهای وسیع الطیفی می باشند که قادرند که نسل سوم سفالوسپورین ها )از جمله سفتازیدیم سفوتاکسیم و سفپودوکسیم( و همچنین مونوباکتام ها )آزترونام( را غیرفعال سازند. زیرگروه :2br شامل بتاالکتامازهایی با تمایل کمتر به کالوالنیک اسید و سولباکتام می باشند. این آنزیم ها را آنزیم های مشتق شده از TEM و 29 مقاوم به مهارکننده می نامند. هرچند این آنزیم ها هنوز به تازوباکتام ها حساس مانده اند.

زیر گروه 2C: این آنزیم ها از گروه 2b جدا شده اند زیرا کاربنی سیلین ها را بیشتر از بنزیل پنی سیلین ها غیرفعال می کنند. هرچند اثر یکسانی بر کلوگزاسیلین دارند. زیرگروه 2d: آنزیم هایی هستند که کلوگزاسیلین ها را بیشتر از بنزیل پنی سیلین ها غیرفعال می سازند در حالی که اثر یکسانی در برابر کاربنی سیلین ها دارند. این آنزیم ها به طور ضعیفی توسط کالوالنیک اسید مهار می شوند. برخی از آنها از نوع ESBL ها هستند. زیرگروه 2e: سفالوسپورینازهایی هستند که قادرند مونوباکتام ها را نیز هیدرولیز نمایند. این آنزیم ها توسط کالوالنیک اسید مهار می شوند. زیر گروه 2f: این آنزیم ها سفالوسپورینازهای دارای جایگاه فعال سرین هستند در حالی که سفالوسپورنیازهای دارای جایگاه فعال روی (Zn) در گروه 3 قرار می گیرند. B گروه 3 شامل بتاالکتامازهای برپایه جایگاه فعال روی می باشند که مشابه کالس مولکولی هستند. این آنزیم ها قادرند که پنی سیلین ها و سفالوسپورین ها و کرباپنم 2f ها را هیدرولیز نمایند. بنابراین کرباپنم ها توسط هر دو گروه )مکانیسم بر پایه سرین( و گروه 3 )مکانیسم بر پایة روی( مهار می شوند. گروه 4 شامل پنی سیلینازهایی هستند که توسط کالوالنیک اسید مهار می شوند در طبقه بندی مولکولی برای آنها مشابهی نیافته اند) 32 (. 30

جدول 2-1 : طبقه بندی بتاالکتامازها) 32 ( اما ارتباطات اساسی آنزیم های بتاالکتام به بهترین نحو در طبقه بندی Ambler آمده است که بر پایه تشابه توالی اسید آمینه ها به جای خواص فنوتیپی)در سیستم طبقه بندی (Bush- Jacoby پایه ریزی شده اند. 31

مطابق طبقه بندی Ambler بتاالکتامازها در چهار کالس مولکولی تکاملی مجزا با سکانس موتایفی جداگانه برای هر کدام طبقه بندی شده اند. کالس های C A و D دارای اسید آمینه سرین در جایگاه فعال خود هستند و این در حالی است که کالس B یا متالوبتاالکتامازها برای فعالیت به روی وابسته اند. اکثر ESBL ها به کالس مولکولی A و D در طبقه بندی Ambler تعلق دارند که به واسطه داشتن جایگاه فعال سرین مشخص می شوند. ESBL های مشتق از SHV و TEM به آنزیم های کالس A تعلق داشته و این در حالی است که ESBL های مشتق از OXA به کالس مولکولی D )اگزاسیلینازها( تعلق دارند )33 34(. چنان که گفته شد آنزیم های بتاالکتاماز طبق طبقه بندی Ambler به 4 گروه اصلی C, B, A و D تقسیم می شوند: گروه A که سبب هیدرولیز پنی سیلین و سفالوسپورین های طیف باریک می شوند شامل و SHV-1 بوده و غالبا در باکتری هایی مانند اشرشیاکلی و کلبسیال TEM-2 TEM-1 پنومونیه شناسایی شده اند) 35-42 (. همانطور که در جدول آمده است 5-1 بخش عمده ای از ژنهای کد کننده بتاالکتامازهای این گروه ماهیت اینتگرونی داشته و توسط این عناصر سیار ژنتیکی انتقال می یابند. 32

جدول 3-1 : ژن های بتاالکتامازی کالس ملکولی A با منشا اینتگرون) 50 ( گروه B شامل متالوبتاالکتامازهای) MBLs ( وابسته به روی) Zn ( می باشند که قادر به هیدرولیز کارباپنم ها بوده و در باکتری هایی مانند سودوموناس آئروژینوزا گزارش شده اند. اکثر ژنهای کد کننده این آنزیم ها نیز ماهیت اینتگرونی داشته و توسط آنها انتقال می یابند. بخشی از ژنهای بتاالکتامازی گروهB با منشا اینتگرونی در جدول 3-1 آمده است )43(. 33

جدول 4-1 : ژن های بتاالکتامازی کالس ملکولی B با منشا اینتگرون) 50 ( گروه C که از آنها می توان AmpC سفالوسپورین ها می باشند) 44 (. بتاالکتامازها را نام برد قادر به تجزیه ی سفومایسین ها و و گروه D بتاالکتامازهایی با قدرت هیدرولیز زیاد مانند OXA که علیه اگزاسیلین و کلوگزاسیلین بوده و اسید کالوالنیک به طور ضعیف از فعالیت آن ها جلوگیری می کند. بخشی از 34

بتاالکتامازهای مربوط به این کالس همانطور که در جدول 4-1 آمده است ماهیت اینتگرونی دارند.)45-49( جدول 5-1 : ژن های بتاالکتامازی کالس ملکولی D با منشا اینتگرون) 50 ( تعریف آمینوگلیکوزیدها این دسته از داروها سنتز پروتئین در باکتریها را مهار می کنند. استرپتومایسین نئومایسین کانامایسین آمیکاسین جنتامایسین و... از مهمترین داروهای این مجموعه می باشند. این داروها از طریق مهار زیر واحد 30s ریبوزومی عمل می کنند. بروز مقاومت دارویی نسبت به این داروها عمدتا" از طریق روش های زیر صورت می پذیرد: 1( کاهش تمایل در گیرنده ریبوزومی 2( کاهش نفوذپذیری در برابر دارو و فقدان انتقال فعال به درون سلول 35

3( تخریب آنزیمی دارو که شایعترین مکانیسم مقاومت به این داروها محسوب می شود. تا به امروز بیش از 50 آنزیم مختلف شناسایی شده است. ژنهای کد کننده این آنزیم ها به طور معمول بر روی پالسمیدها و سایر عناصر سیار ژنتیکی از جمله اینتگرون ها و ترانسپوزون ها قرار دارند) 51 (. مکانیسم های مقاومت به فلوروکینولونها فلوروکینولون ها در اوایل دهة 1970 عرضه شدند. در ابتدا این عوامل بیشتر جهت درمان عفونتهای ادراری مورد استفاده قرار می گرفتند. ولی بعد از آن کم کم استفاده از این عوامل ضد میکروبی وسیع تر گشت به شکلی که امروزه در درمان اکثر عفونت های مختلف از این عوامل استفاده می شود. استفاده از این عوامل دردهة 1980 بسیار زیاد گردید به شکلی که میزان استفاده از آن در مقایسه با سایر داروهای دیگر به مقدار قابل مالحظه ای پیش گرفت. در اواخر همین دهه بود که اولین موارد مقاومت نسبت به این داروها گزارش گردید. در اوایل این مقاومت میزان بسیار پایینی را شامل می شد. ولی بعدها با استفاده بیشتر از این عوامل داروهایی و استفاده گسترده در درمانهای مختلف میزان مقاومت با سرعت بسیار زیادتری نسبت به قبل رو به افزایش نهاد) 52 (. عموما مقاومت نسبت به فلوروکینولونها در چند مکانیسم خالصه می شود که مهمترین آنها موتاسیون های ایجاد شده در آنزیم های هدف فلوروکینولونها شامل آنزیم های DNA ژیراز و توپوایزومراز IV است. همچنین مهار تجمع و کاهش غلظت دارو در باکتریها از دیگر مکانیسم های کاهش حساسیت و ایجاد مقاومت در باکتریهای مختلف می باشد. از آنجایی که ظهور فلوروکینولونهای جدید بیشتر در درمان عفونتهای دستگاه ادراری و بیشتر عفونتهای تنفسی می باشد در نتیجه مقاومت باکتریهای ایجاد کنندة این عفونتها به این عوامل ضد باکتریایی جای نگرانی بسیار دارد.) 40 ( به شکلی که مطالعات اخیر در سالهای گذشته مقاومت نسبتا باالیی را در 36

نقاط مختلف دنیا نشان داده است. در حال حاضر نوعی دیگر از مقاومت به این داروها بو واسطه شیوع ژن پالسمیدی qnr گزارش می شود. این ژن ها در غالب یک پالسمید گانژوگاتیو انتقال یافته و باعث ایجاد مقاومت نسبت به کینولونها می باشد) 53-55 (. الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در بخش مراقبت ویژه ICU( ) بر اساس نتایج مطالعات مختلف در سراسر جهان مقاومت های ضد میکروبی در بیماران بستری در بخش ICU از اهمیت ویژه ای برخوردارند. این امر عمدتا به دنبال درمان ناکامل با آنتی بیوتیک هاست که غالبا مقاومت های ضد میکروبی را به همراه دارد. بستری طوالنی مدت در بیمارستان و نقایص درمانی آنتی بیوتیکی دوران نقاهت نیز از عوامل اصلی افزایش الگوی مقاومت دارویی در بخش های مراقبت ویژه هستند. بیماران بستری در بخش ICU به سبب راهکارهای تشخیصی- درمانی سریع و تهاجمی که برایشان درنظر گرفته می شود و با توجه به اینکه غالب بیماران بستری در این بخش سیستم ایمنی تضعیف شده داشته و یا از بیماری های شدید و مزمن رنج می برند بیشتر مستعد ابتالء به عفونت با ارگانیسم های مقاوم و کلونیز با آن هستند. فشار انتخابی استفاده از داروهای وسیع الطیف و شلوغی بیش از حد در این بخش از دیگر عوامل مهم و مشکل زا در ارائه راهکارهای صحیح کنترل عفونت محسوب می شوند. مطالعات فراوانی که بر روی های ایزوله جداشده از بخش ICU انجام شد نشان داد که ارتباط بسیار نزدیکی بین استفاده قبلی از داروهای ضد میکروبی و متعاقبا مقاومت های آنتی بیوتیکی وجود دارد. امروزه مشکل باکتریمی ناشی از سویه های مقاوم به دارو در بخش های مختلف بیمارستان به خصوص بخش مراقبت ویژه به طرز شگفت آوری رو به افزایش است. اکثر مطالعاتی که بر روی ایزوله های گونه های کلبسیال مقاوم انجام شد نشان می دهند که میزان ارگانیسم های مقاوم جدا شده از بخش ICU بیشتر از سایر بخش ها می باشد. در مجموع برای غلبه بر این مشکل لزوم 37

دقت و توسعة داروهای ضد میکروبی جدید و به کارگیری ابزارهای جدید و گستردة کنترل عفونت کامال ضروری به نظر می رسد) 56 (. اهمیت بالینی جداسازی اینتگرون ها : امروزه باسیل های گرم منفی دارای اینتگرون باعث نگرانی های جدی برای پزشکان و متخصصان عفونی و کنترل عفونت شده اند. نقش این عناصر در بروز ماهیت مقاومت دارویی چندگانه و مقاومت نسبت به طیف وسیعی از آنتی بیوتیک ها به ویژه آنتی بیوتیک های مصرفی در بیمارستان ها باعث مشکل شدن راهکارهای صحیح درمانی و ابزارهای کنترل عفونت اند. شده مطالعات مختلف نشان داده اند که بیماران آلوده به این ارگانیسم ها به طور معنی داری در مرگ و میر بیماران نقش دارند. لذا پزشکان بالینی باید با اهمیت این آنزیم ها از لحاظ بالینی آشنا بوده و راهکارهای الزم برای برخورد با این مشکل و چگونگی کنترل این عفونت ها را بدانند) 57-59 (. فاکتورهای خطر در انتشار اینتگرون ها : فشار انتخابی و استفادة گسترده از عوامل ضد میکروبی به عنوان یک فاکتور مهم در پیدایش مقاومت های دارویی به ویژه در بخش ICU مطرح اند. مطالعات متعددی که در این زمینه انجام شد ارتباط نزدیک بین استفادة قبلی از آنتی بیوتیک ها و متعاقب آن پیدایش مقاومت های آنتی بیوتیکی در باکتری های گرم منفی را آشکار کرد. بستری طوالنی مدت در بیمارستان راهکارهای تهاجمی که برای بیماران بستری در این بخش درنظر گرفته می شود )نظیر لوله تراشه کانترهای داخل عروقی و کاتترهای ادراری( و مواجه شدن با بیماران آلوده به ارگانیسم های دارای اینتگرون از دیگر عوامل ایجاد خطر در بخش ICU هستند. همچنین بیمارانی که شرایط درمانی بلندمدت برای آنها درنظر گرفته می شود منبع خوبی برای ورود باکتری های مقاوم به بخش ICU هستند. پیگیری نکردن بیمارانی که قبال در چنین بخش هایی بستری بوده اند و یا کلونیز شده اند نیز از دیگر مهمترین فاکتورهای خطر محسوب می شوند) 60 (. 38

روش های کنترل عفونت محدود نمودن استفاده از آنتی بیوتیک های وسیع الطیف معمول ترین راه کنترل شیوع ارگانیسم های دارای اینتگرون است. آلودگی زدائی محیطی جداسازی و ایزوله کردن این بیماران الگوی مصرف صحیح استفاده از آنتی بیوتیک ها آلودگی زدائی بدن استفاده از اسپری های بینی ید-پوودین سازماندهی کارمندان بخش و در موارد بحرانی تعطیلی موقت بخش در کنترل عفونت های ناشی از ارگانیسم های دارای اینتگرون بسیار کمک کننده اند. همچنین ایجاد پروتوکل و راهنمای استفاده صحیح از آنتی بیوتیک ها استفاده از داروهایی با طیف اثر محدودتر و قدیمی تر مشورت با متخصصین بیماری های عفونی و استفاده از برنامه های چرخشی آنتی بیوتیک ها و تغییر آن استفاده از دستکش و گان پرهیز از خود درمانی خصوصا با آنتی بیوتیک های وسیع الطیف بتاالکتام و باالخره ایجاد یک سیاست علمی محدود سازی استفاده از آنتی بیوتیک ها در کشور از راهکارهای مهم کنترل عفونت خصوصا در بخش های مختلف بیمارستان ها به حساب می آید. در صورت امکان بستری بیماران در بخش خصوصی و ترخیص زود هنگام آنها و محدود نمودن حرکت یا جابه جایی آنها جز در موارد ضروری و دور ریختن زباله های بالینی داخل کیسه های مجزا برای دفع مناسب و سوزاندن آنها از دیگر راهکارهای کنترل عفونت محسوب می شوند) 10 (. 39

هدف اصلی طرح : تعیین فراوانی اینتگرون کالس یک در گونه های کلبسیال جدا شده از بیمارستان های شهر قزوین و تهران. اهداف فرعی: - تعی نی فراوانی اینتگرون کالس یک با استفاده از آزمون PCR - تعیین ارتباط ما بین حضور اینتگرون کالس یک و مقاومت دارویی نسبت به آنتی بیوتیک هاای به کار رفته در مطالعه اهداف کاربردی: این مطالعه ضمن شناسایی حضور اینتگرون کالس یک در گونه های کلبسیال جمع آوری شده از بیمارستان های شهر قزوین به بررسی ارتباط با حضور اینتگرون و بروز مقاومت دارویی نسبت به عمده داروهای مصرفی در بیمارستان ها می پردازد و که به لحاظ ماهیت سیار بودن ان عناصر ژنتیکی نتایج می تواند در کنترل و جلوگیری از انتشار بیشتر فاکتور مقاومت در بین ایزوله های بیمارستانی کلبسیال موثر باشد. فرضیه ها یا سؤال های پژوهش: آیا اینتگرون کالس یک دز بین ایزوله های کلبسیال از فراوانی باالیی بر خوردار است آیا ارتباط معنی داری ما بین حضور اینتگرون و مقاومت نسبت به کالس های عمده آنتی بیوتیکی مصرفی در بیمارستان های شهر قزوین وجود دارد 40

266 2007 huan بررسی متون: که توسط ای در مطالعه و همکارانش در سال برروی ایزوله بالینی انترو باکتریاسه انجام شد در مجموع 66 ایزوله )34%( از نظر حضور اینتگرون کالس یک مثبت بودند در ادامه مشخص شد که ایزوله های دارای اینتگرون کالس یک با اختالف معنی داری نسبت به ایزوله های فاقد اینتگرون از مقاومت باالتری نسبت به آنتی بیوتیک های سفالوسپورین, فلوروکینولون و آمینوگلوکوزیدها برخوردار بودند) 61 (. و همکارانش در سال 2010 با بررسی ایزوله های کلبسیالیاسیه مقاوم به سفالوسپورین Bado های اکسی ایمنو و سیپروفلوکساسین جمع آوری شده از بخش مراقبت های ویژه بیمارستانهای 38 اروگوئه از نظر حضور اینتگرون کالس یک مشخص کردند که درصد ازایزوله ها از نظر حضور اینتگرون کالس یک مثبت بودند) 62 (. در مطالعه ای که در سال 2011 توسط Ibrahim و همکارانش بر روی 160 ایزوله کلبسیالیاسیه تولید کننده ESBL در مالزی انجام شد با بررسی حضور اینتگرون کالس یک به روش PCR 64,2 مشخص شد که 62,2 درصد از ایزوله های اشریشیاکلی درصد از ایزوله های کلبسیال درصد از ایزوله ای 50 و کلبسیال درصد از ایزوله های سیتروباکتر به ترتیب از نظر حضور 61,4 اینتگرون کالس یک مثبت بودند) 63 (. 118 2010 در مطالعه ای که توسط Yan و همکارانش در سال برروی ایزوله بالینی گرم منفی در شمال چین انجام شد در مجموع 90 ایزوله ) 76%/3 (از نظر حضور اینتگرون کالس یک مثبت بودند که مشخص شد, ایزوله های دارای اینتگرون از مقاومت دارویی باالتری در برابر آنتی بیوتیک های آمینوگلیکوزیدها, کوتری موکسازول و داروهای بتاالکتام در مقایسه با ایزوله های فاقد اینتگرون برخوردار بودند) 64 (. در مطالعه ای که توسط Mokracka و همکارانش در سال 2003 بر روی 69 ایزوله کلبسیال جدا شده از نمونه های بالینی از قبیل ادرار زخم و خون در لهستان انجام شد مشخص شد که 55 41

درصد از ایزوله ها از نظر اینتگرون کالس یک مثبت بودند. در ادامه با بررسی بیشتر مشخص شد که ارتباط معنی داری مابین حضور اینتگرون کالس یک و مقاومت به آمینوگلیکوزید ها تیکارسیلین پیپراسیلین تری متوپریم-سولفامتوکسازول و تتراسیکلین وجود داشت) 65 (. 2007 در مطالعه دیگری که توسط Peng و همکارانش در سال بر روی یکی دیگر از اعضاء 173 خانواده انتروباکتریاسه, سراشیا مارسسنس, انجام شد از مجموع ایزوله بالینی 70,5%, سراشیامایسنس تولید کننده CTX-M از نظر حضور اینتگرون کالس یک مثبت بودند) 66 (. 191 Peyse در مطالعه ای که در سال 2003 توسط و همکارانش در چین انجام شداز مجموع ایزوله بالینی خانواده انتروباکتریاسه در بیماران بستری, اینتگرون کالس یک شایعترین اینتگرون جدا شده بود. در ادامه مشخص گردید که ایزوله های دارای اینتگرون نسبت به ایزوله های فاقد اینتگرون به طور معنی داری از مقاومت باالتری نسبت به آمپی سیلین, سفوتاکسیم و سیپروفلوکسازین برخوردار بودند) 67 (. 136 Bhattacharjee در مطالعه ای که در سال 2010 توسط و همکارانش بر روی ایزوله کلبسیال پنومونیه یکی دیگر از اعضای خانواده کلبسیالیاسیه انجام شد مشخص شد که 82 درصد ایزوله ها از نظر حضور اینتگرون کالس یک مثبت بودند) 68 (. در مطالعه ای که توسط Peymani و همکارانش در سال 2011 بر روی یکی دیگر از باکتری های گرم منفی دخیل در عفونت های بالینی- اسینتوباکتر بومانی- انجام شد در مجموع مشخص شد که 80 درصد از ایزوله ها الگوی مقاومت دارویی چندگانه )MDR( را نشان دادند که 92/5 درصد از آنها از نظر حضور اینتگرون کالس یک مثبت بودند. در ادامه مشخص شد که ایزوله ای دارای اینتگرون به طور معنی داری نسبت به آنتی بیوتیک های آمینوگلیکوزید ها کینولون ها داروهای بتاالکتام مقاومت باالتری نشان دادند. در این مطالعه ارتباط معنی داری بین حضور اینتگرون 42

کالس یک و مقاومت به آنتی بیوتیک های آمپی سیلین و سفپودوکسیم مشاهده نشد زیرا تمامی ایزوله ها به این دو آنتی بیوتیک مقاوم بودند) 69 (. Machado در مطالعه ای که در سال 2007 توسط و همکارانش بر روی های ایزوله کلبسیالیاسیه تولید کننده ESBL در پرتغال انجام شد با بررسی حضور اینتگرون های کالس یک و دو مشخص شد که %23 در مجموع از ایزوله های کلبسیال کلواکه تولید کننده ESBL از نظر حضور اینتگرونکالس یک مثبت بودند و از نظر حضور اینتگرون کالس دو منفی گزارش شدند) 70 (. White در دیگر مطالعه ای که در سال 2001 توسط و همکارانش بر روی ایزوله های کلبسیالیاسیه جداسازی شده از بیماران مبتال به عفونت های ادراری در استرالیا شد در انجام مجموع %49 از ایزوله ها از ایزوله ها از نظر حضور کالس های اینتگرونی یک دو مثبت بودند. در ادامه مشخص شد که ارتباط معنی داری مابین حضور اینتگرون در ایزوله های مورد مطالعه و مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک های استرپتومایسین جنتامایسین کانامایسین توبرامایسین کوتری موکسازول آمپی سیلین کلرامفنیکل و تتراسیکلین وجود داشت) 71 (. در مطالعه ای که توسط Dakic و همکارانش در سال 2007 بر روی 73 ایزوله کلبسیالیاسیه جدا شده از بیماران سرپایی مبتال به عفونت ادراری در یونان انجام شد در مجموع %50/7 از ایزوله ها نسبت به بیش از سه کالس آنتی بیوتیکی عمده مقاومت نشان داده و در واقع الگوی مقاومت دارویی چندگانه )MDR( نشان دادند. با بررسی حضور کالس های اینتگرون به روش PCR مشخص شدکه در مجموع 13 ایزوله )8/17%( از نظر حضور اینتگرون مثبت بودند. بدین ترتیب که 9 ایزوله) 12%/3 ( از ایزوله ها از نظر حضور اینتگرون کالس یک 2 ایزوله) 2%/7 ( از نظر حضور 2 2 اینتگرون کالس 2 و ایزوله) 2%/7 ( از نظر حضور همزمان اینتگرون های کالس 1 مثبت و بودند. در ادامه مشخص شد که ارتباط کامال" معنی داری مابین حضور اینتگرون در ایزوله های 43

مقاوم و مقاومت نسبت به آموکسی سیلین-کالوالنیک اسید کوتریموکسازول کلرامفنیکل سیپروفلوکساسین نورفلوکساسین نالیدیکسیک اسید تتراسیکلین و داکسی سیکلین وجود داشت) 72 (. 44

جامعه مورد مطالعه و روش نمونه گیری: جمعیت مورد مطالعه عبارتست ایزوله های باکتریایی جدا شده از نمونه های بیولوژیک ارسالی)نظیر: خلط مایع آسیت ادرار مایع نخاع محل زخم و...( به آزمایشگاه میکروب شناسی بیمارستانهای شهر قزوین و تهران است. α=0/05 جهت برآورد حجم نمونه از فرمول برآورد نسبت استفاده می شود. با در نظر گرفتن شیوع اینتگرون در گونه های مقاوم کلبسیالP=0/5 و دقت 0/08 تعداد 100 نمونه مثبت از نظر گونه های کلبسیال در نظر گرفته میشود. ایزوله های جدا کلبسیال سازی شده جهت انجام مراحل تحقیق درفریزرº 70C- نگهداری خواهد شد. نوع مطالعه توصیفی بوده و معیارهای ورود به مطالعه شامل موارد زیر است : 1- نمونه های ارسالی که از نظر رشد گونه های کلبسیال مثبت باشد. و معیارهای خروج از مطالعه نیز شامل موارد زیر می باشد: 1- نمونه های ارسالی که نتیجه کشت آنها سایرباکتری های بجز گونه های کلبسیال باشد. 2- بیمارانی که نمونه های ارسالی آنان تکراری باشد. 45

نمونه برداری: تعداد 100 نمونه از گونه های مختلف جنس کلبسیال از بخش های مختلف بیمارستان شهر های قزوین و تهران از خرداد ماه سال 90 تا خرداد ماه 91 جمع آوری گردید. ایزوله های باکتریایی از نمونه های بالینی ادرار و کاتترهای ادراری تراشه خلط خون و سایر نمونه های بالینی جمع آوری شدند. ایزوله های جداسازی شده در آزمایشگاه های بیمارستان های بر روی دو محیط پایه بالد آگار و EMB پاساژ داده شده و به گروه میکرب شناسی و مرکز تحقیقاتی سلولی و ملکولی 35 C دانشگاه علوم پزشکی قزوین انتقال داده شدند و پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای توسط آزمایش های بیوشیمیایی مربوط به شناسایی جنس کلبسیال مورد بررسی قرار گرفتند. تست های بیوشیمیایی که برای شناسایی جنس کلبسیال مورد استفاده قرار گرفتند عبارتند از: کشت بر روی محیط مک کانگی آگار رنگ آمیزی گرم انجام آزمون اکسیداز کشت بر روی محیط کلیگلر ایرون آگار (KIA) آزمایش اندول )کشت بر روی محیط )SIM آزمایش متیل رد )کشت بر روی محیط )MRVP آزمایش ووگس پروسکوئر )کشت بر روی محیط )MRVP آزمایش سیترات )کشت بر روی محیط سیمون سیترات( آزمایش هیدرولیز اوره )کشت بر روی محیط اوره آگار(.1.2.3.4.5.6.7.8.9 10. تست حرکت )کشت بر روی محیط )2()SIM 46

بعد از انجام تعیین هویت ایزوله ها به منظور نگهداری طوالنی مدت باکتریها ابتدا آنها را در ویال 24 های حاوی محیط کشت تریپتی کیز سوی براث Broth) (TSB کشت داده و بعد از ساعت انکوباسیون در دمای 35 C در صورت رشد باکتری یک یا دو قطره گلیسرول %20 استریل به آن اضافه کرده و سپس تا زمان انجام تست های مطالعه در فریزر - 20 C نگهداری شدند. تعیین الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی به روش Disk Agar Diffusion برای انجام آزمون از دستورالعمل موسسه بین المللی استانداردهای آزمایشگاهی )CLSI( استفاده شد و به شرح ذیل انجام شد) 68 (. 7/4 7/2 ابتدا محیط مولر هینتون آگار تهیه شد و ph تا آن بین تنظیم گردید. این -1 انکوبه شدند. پلیت ها برای کنترل آلودگی به مدت 24 ساعت در دمای 35 C 2- در مرحلة بعد ظروف حاوی دیسک های آنتی بیوتیک جنتامایسین آموکسی سیلین / کالوالنیک اسید پیپراسیلین /تازوباکتام تیکارسیلین/کالونیک اسید سفپیم سفوتاکسیم, سفتریاکسون, سفتازیدیم, سفپودوکسیم, آزترونام ایمیپنم مروپنم سیپروفلوکساسین پیپراسیلین نورفلوکسازین گتی فلوکسازین نیتروفورانتوئین تری متوپریم- سولفومتوکسازول تیگسیکلین برای انجام آزمون از فریزر 20 - C )نگهداری بلند مدت( به یخچال 4 C )نگهداری کوتاه مدت( انتقال داده شدند. چند دقیقه قبل از انجام تست نیز ظروف حاوی دیسک ها در محیط آزمایشگاه قرار گرفتند تا به دمای اتاق برسند. دیسک های آنتی بیوتیکی از شرکت MAST انگلستان خریداری شدند. 3- در مرحله بعد سوسپانسیون میکروبی استاندارد جهت انجام آزمون تهیه شد. از آن جا که برای تهیه سوسپانسیون از سویه هایی که بیش از 24 ساعت از کشت آن ها نگذشته 47 باشد استفاده می شود لذا نمونه ها یک روز قبل از انجام آزمایش بر روی محیط ژلوز

ساده کشت داده شدند. سپس در دمای 35 C به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. میزانی از کلونی را به لوله حاوی 2 ml سرم فیزیولوژی استریل انتقال داده و بعد از مخلوط کردن با میکسر سوسپانسیونی به دست آمد که غلظت باکتری در آن برابر با غلظت نیم مک فارلند بود. 4- با استفاده از یک سوآپ کتان استریل سوسپانسیون را بر روی محیط مولر هینتون آگار تهیه شده به روش چمنی پخش کردیم. 15 دقیقه پس از تلقیح سوسپانسیون دیسک های آنتی بیوتیکی فوق الذکر را که به دمای اتاق رسیده بودند بر روی پلیت به فاصله حداقل 1 cm از یکدیگر قرار دادیم. 5- پس از دیسک گذاری پلیت ها به مدت 24 ساعت در دمای 35 C انکوبه شدند. سپس با استفاده از خط کش قطر هاله عدم رشد اطراف هر دیسک اندازه گیری و نتایج مربوطه های تهیه شده یادداشت شدند. فرم در در این آزمون از سویه کنترل E.coli ATCC 25922 جهات کنتارل انجاام آزماون گردید. اساتفاده بررسی ملکولی شیوع اینتگرون کالس یک برای تعیین شیوع اینتگرون کالس یک از آزمایش واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) استفاده می کنیم. در این روش از پرایمر مخصوص ژن داخلی اینتگرون کالس یک استفاده شد که با تکثیر ژن مورد نظر و نهایتا الکتروفورز محصوالت بر روی ژل آگارز حضور و یا عدم حضور آن مشخص خواهد شد. 48

استخراج DNA Boiling ESBL مراحل استخراج DNA از سویه های تولید کنندة با استفاده از روش شرح به زیر انجام شد: 1. ابتدا 3 تا 5 کلنی از هر نمونه را داخل ویال اپندورف 1/5 ml حاوی 200 آب مقطر shake می کنیم تا اینکه کامال حل شود. استریل حل می کنیم. 2. با استفاده از شیکر آنقدر نمونه ها را 3. ویال ها را به مدت 10-15 دقیقه داخل بن ماری جوش ( C 100 ( قرار می دهیم به طوری که سطح آب جوش دوسوم ویال را در برگیرد. در این مرحله ویال ها را به مدت 5-10 دور دقیقه با 14000 سانتریفوژ می کنیم..4 که البته در این مرحله از سانتریفوژ اپندورف استفاده کردیم. 5. محلول رویی )سوپرناتانت( ویالها برای انجام واکنش PCR به اپندورف استریل منتقل شد. در این مرحله پس از انجام استخراج برای اطمینان از وجود DNA توتال از نانودراپ در دو طول موج 260/280 نانومتر استفاده شد. دستگاه.6 آماده سازی پرایمرها: 1. ابتدا توالی پرایمرها جهت ساخت تحویل شرکت دانمارکی شد. پرایمرها پس از طراحی به صورت لیوفیلیزه دریافت شدند. برای تهیه محلول ذخیره برطبق دستورالعمل )برگه آنالیز( همراه پرایمر عمل شد. 49

2. توالی پرایمرها به شرح ذیل استفاده شد: IntF, 5 -ATCATCGTCGTAGAGACGTCGG IntR, 5 -GTCAAGGTTCTGGACCAGTTGC (69) 3. در مرحله بعد ویالهای حاوی پرایمر به مدت 0/5 ساعت در دمای 37 C قرار گرفتند. -20 C در این مرحله محلول استوک 100 mol تهیه و سپس در دمای نگهداری.4 شدند. 10 بسته به کار روزانه برای تهیه محلول کار پرایمرهای با غلظت mol دو رشتة از هر.5 ژن تهیه و برای هر سری از واکنش های PCR استفاده شد. انجام آزمون PCR در این مرحله ابتدا Matermix تهیه شد)جدول 1-3 (. سپس با پرایمرهای از استفاده اختصاصی اینتگرون ژن شناسایی و تکثیر کالس یک صورت گرفت. برای انجام واکنش PCR حجم نهایی واکنش هر 25 میکرولیتری بود. برای به دست آوردن بهترین مقدار از ترکیبات مورد استفاده )مثل شد. PCR گرادیانی از مقادیر مختلف این ترکیبات طی چند واکنش مختلف )Mgcl 2 انجام تصویر 1-3: انجام الکتروفورز 50 محصول PCR

جدول 1-3 مقادیر بهینه برای تهیه master mix یک واکنش PCR حجم )میکرولیتر( ترکیب DNTP mix 10 mmol 2 PCR Buffer 10 X 10 Mgcl2 50 mmol 3 D.H2O 73 آماده سازی واکنش : PCR با درنظر گرفتن حجم نهایی هر واکنش PCR که 25 میکرولیتر بود حجم پرایمرها DNA الگو و آنزیم پلی مرازکه باید به master mix اضافه شوند به شرح ذیل در جدول 2-3 آمده است. جدول 2-3: مواد ملکولی مورد نیاز جهت انجام یک واکنش PCR حجم )میکرولیتر( ترکیب Master mix 22 DNA Template 1 Primer F Primer R 1 1 Taq pol 5 u/ l 0/25 51

برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر (Thermocycler) : پس از قرار دادن ویال ها در دستگاه ترموسایکلر شرایط دمایی مختلف و زمان های آن ها در یک واکنش PCR برطبق جدول زیر اجرا گردید. جدول 3-3: شرایط برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر در یک واکنش PCR زمان دما)سانتی گراد( First denaturation 95 5 min 95 1 min Cycle(30) 55 30sec 72 1 min Final extention 72 10 min الکتروفورز محصوالت PCR %1 برای انجام الکتروفورز روی محصوالت حاصل از PCR از ژل آگارز استفاده شد. میزان 100 پودر آگارز را در cc بافر TBE 1X حل کرده و بعد از حرارت دادن و خنک شدن به 1gr DNA میزان 1 میکرولیتر µg/ml( 10( سایبرگرین )برای رنگ آمیزی قطعات ) به آن اضافه کردیم. پس از مخلوط کردن محلول را داخل قالب ریخته و پس از بسته شدن ژل آن را از قالب 3 PCR خارج و به داخل تانک الکتروفورز انتقال دادیم. مقدار 7 میکرولیتر از محصول را با 52

میکرولیتر loading Buffer 6 X مخلوط کرده و در داخل چاهک های ژل برای الکتروفورز قرار دادیم. برای انجام الکتروفورز ولتاژ روی 100 ولت تنظیم گردید وقتی نمونه سه چهارم طول ژل را طی کرد ژل از تانک خارج و با المپ UV مشاهده شد. در صورت مناسب بودن باندهای حاصل از الکتروفورز ژل را با دستگاه UVP تهیه کردیم. موردمشاهده قرار داده و از تصویر ژل مربوطه عکس کنترل کیفی برای اطمینان از صحت انجام آزمایش از سویه کنترل اسینتوباکتر بومانی حاوی شده تائید اینتگرون کالس یک به عنوان کنترل مثبت و اشرشیاکلی 25922 به عنوان کنترل منفی استفاده شد. همچنین برای کنترل انجام آزمون از میکروتیوب های حاوی مواد واکنش بدون DNA الگو استفاده شد. بررسی ارتباط بین حضور اینتگرون و مقاومت آنتی بیوتیکی: و اینتگرون حضور بالینی ارتباط دو کالی مجذور آزمون از استفاده با ارتباط این ادامه در مقاومت به داروهای به کار رفته با استفاده از نرم افزار SPSS ویرایش 16 در مطالعه مورد بررسی قرار گرفت. مقدار P value کمتر از 0,05 از لحاظ آماری معنی دار در نظر گرفته شد. 53

در این مطالعه 100 ایزوله از گونه های کلبسیال پس از انجام تست های استاندارد آزمایشگاهی و میکرب شناسی جمع آوری شدند)تصویر 1-3 (. در انجام آزمون اکسیداز از سویه های استاندارد E. coli ATCC مثبت( و )کنترل Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 25922 )کنترل منفی( استفاده شد. تصویر 1-4 : سمت راست: نتیجه آزمون اکسیداز سمت چپ: نتیجه تست های فنوتیپی تعیین هویت)از TSI تحرک مثبت و اندول منفی در محیط SIM متیل رد منفی چپ به راست: قلیا/قلیا در محیط VP مثبت و سیترات مثبت. همانطور که در نمودار نشان داده شده است نمونه های بالینی از بیماران بستری در بخش 1-4 )65-47%( داخلی )%27-37( اعصاب )12-9%( جراحی )9-7%( عفونی) 8-%6 ( و های ICU ارتوپدی) 6-%4 ( به ترتیب جمع آوری شدند. 54

نمودار 1-4 : فراوانی ایزوله های کلبسیال بر حسب بخش های بیمارستانی 29 30 از این بیماران در مجموع 37 نمونه )27 %( از ادرار ایزوله )22%( از ایزوله خون نمونه )21%( از نمونه تراشه 20 ایزوله )15%( از نمونه زخم 7 ایزوله )5%( از کاتتر 43 ایزوله )3%( از نمونه خلط و 6 ایزوله )4%( از سایر نمونه های بالینی جمع آوری شدند. نمودار 2-4 فراوانی گونه کلبسیال های را در برحسب منبع و نوع نمونه های بالینی ارسالی مراکز مورد مطالعه را نشان می دهد. 55

نمودار 2-4 : فراوانی ایزوله های کلبسیال بر حسب نمونه های بالینی 51 در ادامه با بررسی اطالعات بیماران مشخص شد که 86)63%( از بیماران از جنس مرد و )37%( بیماران از جنس زن بودند )نمودار 3-4 (. نمودار 3-4 : فراوانی ایزوله های کلبسیال بر حسب جنس با بررسی میانگین سنی بیماران مشخص شد که بیماران هدف در این مطالعه در محدوده سنی 17 تا 83 سال قرار داشتند که میانگین سنی آنها 50±20 تعیین شد. 56

الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی با انجام تست حساسیت آنتی بیوتیکی به روش DAD مشخص گردید که 83 ایزوله )83%( الگوی مقاومت داروئی چندگانه را نشان دادند و به کالسهای آنتی بیوتیکی بتاالکتام آمینوگلیکوزید و کینولون مقاومت داروئی کامل یا حد واسط نشان دادند. از این تعداد 2 ایزوله )2.4%( به ایمی پنم مقاومت کامل 12 ایزوله )5/14%( مقاومت متوسط و 69 ایزوله )1/83%( حساسیت نشان دادند. همچنین مشخص شد که از بین ارگانیسم های با مقاومت دارویی چندگانه 80 ایزوله )4/96%( به مروپنم حساسیت و 3 ایزوله) 3%/6 ( مقاومت حدواسط نشان دادند. شناسایی ملکولی اینتگرون کالس یک با انجام آزمون PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی اینتگرون کالس یک بر روی 100 ایزوله کلبسیال مشخص شد که در مجموع 73 ایزوله) 73% ( دارای اینتگرون کالس یک بودند. در ادامه همچنین مشخص شد که از مجموع 83 ایزولة دارای الگوی مقاومت دارویی چندگانه 52 ایزوله )63%( از نظر حضور اینتگرون کالس یک مثبت بودند)جدول 1-4 (. در ادامه بر اساس نتایج انجام آزمون آماری مجذور کای دو ارتباط معنی داری )0.001 < p( مابین حضور اینتگرون کالس یک و الگوی مقاومت دارویی چندگانه گزارش شد. 1000bp 893bp 57